Was ist CRISPR?

Die CRISPR-Technologie ist ein einfaches und dennoch leistungsstarkes Tool zum Bearbeiten von Genomen. Es ermöglicht Forschern, DNA-Sequenzen leicht zu verändern und die Genfunktion zu modifizieren. Zu seinen zahlreichen Anwendungsmöglichkeiten gehören die Korrektur genetischer Defekte, die Behandlung und Verhinderung der Ausbreitung von Krankheiten sowie die Verbesserung der Ernte. Das Versprechen wirft jedoch auch ethische Bedenken auf.

In der populären Verwendung ist "CRISPR" (ausgesprochen "knuspriger") die Abkürzung für "CRISPR-Cas9". CRISPRs sind spezialisierte DNA-Abschnitte. Das Protein Cas9 (oder "CRISPR-assoziiert") ist ein Enzym, das wie eine molekulare Schere wirkt und DNA-Stränge schneiden kann.

Die CRISPR-Technologie wurde an die natürlichen Abwehrmechanismen von Bakterien und Archaeen (der Domäne einzelliger Mikroorganismen) angepasst. Diese Organismen verwenden CRISPR-abgeleitete RNA und verschiedene Cas-Proteine, einschließlich Cas9, um Angriffe durch Viren und andere Fremdkörper abzuwehren. Sie tun dies hauptsächlich, indem sie die DNA eines fremden Eindringlings zerhacken und zerstören. Wenn diese Komponenten in andere, komplexere Organismen übertragen werden, können Gene manipuliert oder "bearbeitet" werden.

Bis 2017 wusste niemand wirklich, wie dieser Prozess aussah. In einem am 10. November 2017 in der Zeitschrift Nature Communications veröffentlichten Artikel zeigte ein Forscherteam unter der Leitung von Mikihiro Shibata von der Kanazawa University und Hiroshi Nishimasu von der University of Tokyo, wie es aussieht, wenn ein CRISPR zum ersten Mal in Aktion ist Zeit. [Ein atemberaubendes neues GIF zeigt CRISPR Chewing Up DNA]

CRISPR-Cas9: Die Hauptakteure

CRISPRs:: ""CRISPR "steht für" Cluster von regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Wiederholungen. "Es handelt sich um eine spezialisierte DNA-Region mit zwei unterschiedlichen Merkmalen: das Vorhandensein von Nukleotid-Wiederholungen und Spacern. Wiederholte Sequenzen von Nukleotiden - die Bausteine ​​der DNA - sind in einem CRISPR verteilt Spacer sind DNA-Teile, die zwischen diesen wiederholten Sequenzen verteilt sind.

Bei Bakterien werden die Spacer Viren entnommen, die zuvor den Organismus angegriffen haben. Sie dienen als Erinnerungsbank, die es Bakterien ermöglicht, die Viren zu erkennen und zukünftige Angriffe abzuwehren.

Dies wurde erstmals experimentell von Rodolphe Barrangou und einem Forscherteam von Danisco, einem Unternehmen für Lebensmittelzutaten, demonstriert. In einem 2007 in der Zeitschrift Science veröffentlichten Artikel verwendeten die Forscher Streptococcus thermophilus Bakterien, die häufig in Joghurt und anderen Milchkulturen vorkommen, als Modell. Sie beobachteten, dass nach einem Virusangriff neue Spacer in die CRISPR-Region eingebaut wurden. Darüber hinaus war die DNA-Sequenz dieser Spacer mit Teilen des Virusgenoms identisch. Sie manipulierten auch die Spacer, indem sie sie herausnahmen oder neue virale DNA-Sequenzen einfügten. Auf diese Weise konnten sie die Resistenz der Bakterien gegen einen Angriff durch ein bestimmtes Virus verändern. Somit bestätigten die Forscher, dass CRISPRs eine Rolle bei der Regulierung der bakteriellen Immunität spielen.

CRISPR-RNA (crRNA): Sobald ein Spacer eingebaut ist und das Virus erneut angreift, wird ein Teil des CRISPR transkribiert und in CRISPR-RNA oder "crRNA" verarbeitet. Die Nukleotidsequenz des CRISPR fungiert als Matrize zur Erzeugung einer komplementären Sequenz einzelsträngiger RNA. Jede crRNA besteht aus einer Nukleotidwiederholung und einem Spacer-Teil. Dies geht aus einem Bericht von Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier aus dem Jahr 2014 hervor, der in der Zeitschrift Science veröffentlicht wurde.

Cas9: Das Cas9-Protein ist ein Enzym, das fremde DNA schneidet.

Das Protein bindet typischerweise an zwei RNA-Moleküle: crRNA und eine andere, die als tracrRNA (oder "transaktivierende crRNA") bezeichnet wird. Die beiden führen Cas9 dann zu der Zielstelle, an der es seinen Schnitt machen wird. Diese DNA-Ausdehnung ist komplementär zu einem 20-Nucleotid-Abschnitt der crRNA.

Unter Verwendung von zwei getrennten Regionen oder "Domänen" in seiner Struktur schneidet Cas9 beide Stränge der DNA-Doppelhelix und bildet so einen sogenannten "doppelsträngigen Bruch", so der Wissenschaftsartikel von 2014.

Es gibt einen eingebauten Sicherheitsmechanismus, der sicherstellt, dass Cas9 nicht irgendwo in ein Genom schneidet. Kurze DNA-Sequenzen, die als PAMs bekannt sind ("Protospacer-Nachbarmotive"), dienen als Tags und sitzen neben der Ziel-DNA-Sequenz. Wenn der Cas9-Komplex kein PAM neben seiner Ziel-DNA-Sequenz sieht, schneidet er nicht. Dies ist ein möglicher Grund dafür, dass Cas9 laut einer 2014 in Nature Biotechnology veröffentlichten Übersicht die CRISPR-Region in Bakterien niemals angreift.

CRISPR-Cas9 als Genom-Editing-Tool

Die Genome verschiedener Organismen codieren eine Reihe von Nachrichten und Anweisungen in ihren DNA-Sequenzen. Bei der Bearbeitung des Genoms werden diese Sequenzen geändert, wodurch die Nachrichten geändert werden. Dies kann erreicht werden, indem ein Schnitt oder Bruch in die DNA eingefügt wird und die natürlichen DNA-Reparaturmechanismen einer Zelle dazu gebracht werden, die gewünschten Änderungen einzuführen. CRISPR-Cas9 bietet hierfür ein Mittel.

2012 wurden in den Fachzeitschriften Science und PNAS zwei wichtige Forschungsarbeiten veröffentlicht, die dazu beitrugen, das bakterielle CRISPR-Cas9 in ein einfaches, programmierbares Werkzeug zur Bearbeitung des Genoms umzuwandeln.

Die von getrennten Gruppen durchgeführten Studien kamen zu dem Schluss, dass Cas9 angewiesen werden könnte, jede Region der DNA zu schneiden. Dies könnte durch einfaches Ändern der Nukleotidsequenz von crRNA erfolgen, die an ein komplementäres DNA-Ziel bindet. In dem Wissenschaftsartikel 2012 haben Martin Jinek und Kollegen das System weiter vereinfacht, indem sie crRNA und tracrRNA zu einer einzigen "Leit-RNA" verschmolzen haben. Daher erfordert die Bearbeitung des Genoms nur zwei Komponenten: eine Leit-RNA und das Cas9-Protein.

"Operativ entwerfen Sie eine Strecke von 20 [Nucleotid] -Basenpaaren, die zu einem Gen passen, das Sie bearbeiten möchten", sagte George Church, Professor für Genetik an der Harvard Medical School. Ein zu diesen 20 Basenpaaren komplementäres RNA-Molekül wird konstruiert. Church betonte, wie wichtig es ist, sicherzustellen, dass die Nukleotidsequenz nur im Zielgen und nirgendwo anders im Genom gefunden wird. "Dann schneidet die RNA plus das Protein [Cas9] - wie eine Schere - die DNA an dieser Stelle und im Idealfall nirgendwo anders", erklärte er.

Sobald die DNA geschnitten ist, greifen die natürlichen Reparaturmechanismen der Zelle ein und bewirken Mutationen oder andere Veränderungen im Genom. Dies kann auf zwei Arten geschehen. Laut dem Huntington's Outreach Project an der Stanford (University) besteht eine Reparaturmethode darin, die beiden Schnitte wieder zusammenzukleben. Diese Methode, die als "nicht homologe Endverbindung" bekannt ist, führt tendenziell zu Fehlern. Nukleotide werden versehentlich inseriert oder deletiert, was zu Mutationen führt, die ein Gen stören können. Bei der zweiten Methode wird der Bruch behoben, indem die Lücke mit einer Sequenz von Nukleotiden gefüllt wird. Zu diesem Zweck verwendet die Zelle einen kurzen DNA-Strang als Matrize. Wissenschaftler können die DNA-Vorlage ihrer Wahl bereitstellen und so jedes gewünschte Gen einschreiben oder eine Mutation korrigieren.

Nutzen und Einschränkungen

CRISPR-Cas9 ist in den letzten Jahren populär geworden. Church stellt fest, dass die Technologie einfach zu bedienen und etwa viermal effizienter ist als das bisher beste Tool zur Bearbeitung des Genoms (TALENS)..

2013 veröffentlichten Forscher aus den Labors von Church und Feng Zhang vom Broad Institute des Massachusetts Institute of Technology und Harvard die ersten Berichte über die Verwendung von CRISPR-Cas9 zur Bearbeitung menschlicher Zellen in einem experimentellen Umfeld. Studien mit In-vitro- (Labor-) und Tiermodellen menschlicher Krankheiten haben gezeigt, dass die Technologie bei der Korrektur genetischer Defekte wirksam sein kann. Beispiele für solche Krankheiten sind Mukoviszidose, Katarakt und Fanconi-Anämie. Dies geht aus einem Übersichtsartikel aus dem Jahr 2016 hervor, der in der Zeitschrift Nature Biotechnology veröffentlicht wurde. Diese Studien ebnen den Weg für therapeutische Anwendungen beim Menschen.

"Ich denke, die öffentliche Wahrnehmung von CRISPR konzentriert sich sehr auf die Idee, Gen-Editing klinisch zur Heilung von Krankheiten einzusetzen", sagte Neville Sanjana vom New York Genome Center und Assistenzprofessor für Biologie, Neurowissenschaften und Physiologie an der New York University. "Dies ist zweifellos eine aufregende Möglichkeit, aber dies ist nur ein kleines Stück."

Die CRISPR-Technologie wurde auch in der Lebensmittel- und Agrarindustrie eingesetzt, um probiotische Kulturen zu entwickeln und Industriekulturen (zum Beispiel für Joghurt) gegen Viren zu impfen. Es wird auch in Kulturpflanzen eingesetzt, um den Ertrag, die Trockenheitstoleranz und die Ernährungseigenschaften zu verbessern.

Eine andere mögliche Anwendung ist die Erzeugung von Genantrieben. Dies sind genetische Systeme, die die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass ein bestimmtes Merkmal vom Elternteil an die Nachkommen weitergegeben wird. Nach Angaben des Wyss Institute breitet sich das Merkmal im Laufe der Generationen über ganze Bevölkerungsgruppen aus. Genantriebe können bei der Kontrolle der Ausbreitung von Krankheiten wie Malaria helfen, indem sie die Sterilität des weiblichen Krankheitsüberträgers verbessern Anopheles gambiae Mücken - laut Artikel über Naturbiotechnologie 2016. Darüber hinaus könnten Genantriebe auch verwendet werden, um invasive Arten auszurotten und die Resistenz gegen Pestizide und Herbizide umzukehren. Dies geht aus einem Artikel von Kenneth Oye und Kollegen aus dem Jahr 2014 hervor, der in der Zeitschrift Science veröffentlicht wurde.

CRISPR-Cas9 ist jedoch nicht ohne Nachteile.

"Ich denke, die größte Einschränkung von CRISPR ist, dass es nicht hundertprozentig effizient ist", sagte Church. Darüber hinaus können die Effizienz der Genombearbeitung variieren. Laut dem Wissenschaftsartikel von Doudna und Charpentier aus dem Jahr 2014 wurde in einer Studie mit Reis in fast 50 Prozent der Zellen, die den Cas9-RNA-Komplex erhielten, eine Geneditierung durchgeführt. Andere Analysen haben gezeigt, dass die Bearbeitungseffizienz je nach Ziel bis zu 80 Prozent oder mehr erreichen kann.

Es gibt auch das Phänomen der "Off-Target-Effekte", bei denen DNA an anderen Stellen als dem beabsichtigten Ziel geschnitten wird. Dies kann zur Einführung unbeabsichtigter Mutationen führen. Darüber hinaus stellte Church fest, dass selbst wenn das System das Ziel erreicht, die Möglichkeit besteht, dass keine genaue Bearbeitung erfolgt. Er nannte das "Genomvandalismus".

Grenzen setzen

Die vielen möglichen Anwendungen der CRISPR-Technologie werfen Fragen zu den ethischen Vorzügen und Konsequenzen von Manipulationen am Genom auf.

In dem Wissenschaftsartikel 2014 weisen Oye und Kollegen auf die möglichen ökologischen Auswirkungen der Verwendung von Genantrieben hin. Ein eingeführtes Merkmal könnte sich durch Kreuzung über die Zielpopulation hinaus auf andere Organismen ausbreiten. Genantriebe könnten auch die genetische Vielfalt der Zielpopulation verringern.

Das Vornehmen genetischer Veränderungen an menschlichen Embryonen und Fortpflanzungszellen wie Spermien und Eiern wird als Keimbahnbearbeitung bezeichnet. Da Änderungen an diesen Zellen an nachfolgende Generationen weitergegeben werden können, hat die Verwendung der CRISPR-Technologie zur Durchführung von Keimbahnänderungen eine Reihe ethischer Bedenken aufgeworfen.

Variable Wirksamkeit, nicht zielgerichtete Effekte und ungenaue Änderungen stellen Sicherheitsrisiken dar. Darüber hinaus gibt es vieles, was der wissenschaftlichen Gemeinschaft noch unbekannt ist. In einem 2015 in Science veröffentlichten Artikel stellen David Baltimore und eine Gruppe von Wissenschaftlern, Ethikern und Rechtsexperten fest, dass die Bearbeitung von Keimbahn die Möglichkeit unbeabsichtigter Konsequenzen für zukünftige Generationen erhöht, "weil unser Wissen über Humangenetik, Gen-Umwelt-Interaktionen, Grenzen, Grenzen hat. und die Krankheitswege (einschließlich des Zusammenspiels zwischen einer Krankheit und anderen Zuständen oder Krankheiten bei demselben Patienten). "

Andere ethische Bedenken sind differenzierter. Sollten wir Änderungen vornehmen, die zukünftige Generationen ohne deren Zustimmung grundlegend betreffen könnten? Was ist, wenn die Verwendung der Keimbahnbearbeitung von einem therapeutischen Werkzeug zu einem Verbesserungswerkzeug für verschiedene menschliche Eigenschaften wird??

Um diese Bedenken auszuräumen, haben die Nationalen Akademien der Wissenschaften, Ingenieurwissenschaften und Medizin einen umfassenden Bericht mit Richtlinien und Empfehlungen für die Bearbeitung des Genoms zusammengestellt.

Obwohl die Nationalen Akademien bei der Bearbeitung der Keimbahn Vorsicht walten lassen, betonen sie "Vorsicht bedeutet nicht Verbot". Sie empfehlen, die Keimbahnbearbeitung nur an Genen durchzuführen, die zu schweren Krankheiten führen, und nur dann, wenn es keine anderen vernünftigen Behandlungsalternativen gibt. Sie betonen unter anderem die Notwendigkeit, Daten über die Gesundheitsrisiken und -nutzen zu haben und die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Überwachung während klinischer Studien. Sie empfehlen auch, Familien über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen.

Aktuelle Forschung

In jüngster Zeit gab es viele Forschungsprojekte rund um CRISPR. "Das Tempo der Entdeckungen in der Grundlagenforschung ist dank CRISPR explodiert", sagte der Biochemiker und CRISPR-Experte Sam Sternberg, Gruppenleiter für Technologieentwicklung bei Caribou Biosciences Inc. in Berkeley, Kalifornien, der CRISPR-basierte Lösungen für die Medizin entwickelt. Landwirtschaft und biologische Forschung.

Hier sind einige der neuesten Erkenntnisse:

• Im April 2017 veröffentlichte ein Forscherteam in der Zeitschrift Science Forschungsergebnisse, wonach sie ein CRISPR-Molekül programmiert hatten, um Virusstämme wie Zika in Blutserum, Urin und Speichel zu finden.
• Am 2. August 2017 enthüllten Wissenschaftler in der Zeitschrift Nature, dass sie einen Herzkrankheitsdefekt in einem Embryo erfolgreich mit CRISPR entfernt hatten.
• Am 2. Januar 2018 gaben Forscher bekannt, dass sie möglicherweise Pilze und andere Probleme, die die Schokoladenproduktion bedrohen, mit CRISPR stoppen können, um die Pflanzen resistenter gegen Krankheiten zu machen.
• Am 16. April 2018 haben Forscher CRISPR aktualisiert, um Tausende von Genen gleichzeitig zu bearbeiten. Dies geht aus Untersuchungen hervor, die von der Zeitschrift BioNews veröffentlicht wurden.

Zusätzliche Berichterstattung von Alina Bradford, Mitwirkende.

Zusätzliche Ressourcen

• Broad Institute: Ein Zeitplan für die zentrale Arbeit an CRISPR
• Gentechnik & Biotechnologie News: CRISPR-Cas9 durch synthetische Nukleotide 10000-fach verbessert
• Broad Institute: Fragen und Antworten zu CRISPR